大鼠永久性脑缺血后白细胞介素—1 β表达的研究
大鼠永久性脑缺血后白细胞介素—1 β表达的研究
大鼠永久性脑缺血后白细胞介素—1 β表达的研究
中国神经精神疾病杂志 2000年第1期第26卷 论著与学术交流
作者：黄旭升 朱克 任明 田东华 张凤英 刘洁晓
单位：解放军总医院神经内科 100853
关键词： 白细胞介素—1 β；脑缺血；大脑中动脉堵塞；免疫组化
【摘要】 目的 研究白细胞介素—1 β(IL-1 β)在大鼠脑缺血后的表达情况，以探讨脑缺血后脑内是否有内源性的IL-1 β产生，以及由何种细胞产生。方法 采用线堵法使右侧大脑中动脉永久堵塞制成大鼠局灶脑缺血模型，用免疫组化方法，显示IL-1 β在脑内的表达。结果 正常和假手术大鼠脑内以及脑缺血后的非缺血半球未发现有IL-1 β免疫反应阳性细胞。脑缺血3小时后，在缺血区有散在的IL-1 β阳性细胞，呈未活化的星形胶质细胞形态，随缺血时间延长阳性星形胶质细胞数增多，且活化程度越高，到2个月时，坏死灶周围仍有许多IL-1 β阳性、明显活化的星形胶质细胞。结论 脑缺血后3小时至2个月，脑内有内源性的、蛋白水平的IL-1 β产生，来源为星形胶质细胞。IL-1 β可能与星形胶质细胞增生及疤痕形成有密切的关系。
An immunohistochemical study of interleukin—1 β after permanent cerebral ischemia in rats
Huang Xusheng，Zhu Ke，Ren Ming，Tian Donghua，Zhang Fengying，Liu Jiexiao
（Department of Neurology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing. 100853）
【Abstract】Objective To investigate whether there are endogenously produced IL-1 β protein in the brain after cerebral ischemia, if so, to further study its origin and time course of expression. Methods An immunohistochemical method was used to detect the expression of IL-1 β in the brain after a permanent focal cerebral ischemia model was made by using a monofilament nylon thread to occlude the origin of right middle cerebral artery in rat. Results There are not IL-1 β positive immunoreactive cells in the brain of normal and sham-operated rats and nonischemic hemisphere. Scattering distributed IL-1 β positive immunoreactive astrocytes were found only in ischemic region 3 hours after ischemia, after that, the number of IL-1 β positive astrocytes and the extent of its activation was increased in the ischemic hemisphere as time went on, especially the periinfarcted area. Two months after ischemia there were still much IL-1 β immunoreactive positive, prominently activated astrocytes around the necrotic region. Conclusions From 3 hours to 2 months after cerebral ischemia there was astrocytes produced IL-1 β protein in the ischemic hemisphere, and IL-1 β may play a role in the process of astroglial proliferation and scar formation.
【Key words】 interleukin-1 β cerebral ischemia middle cerebral artery occlusion immunohistochemistry
目前已证实大鼠脑缺血后在缺血脑区有白细胞介素—1 β(IL-1 β)mRNA 的表达［1］，在缺血早期，IL-1 β可使脑损伤加重［2］，但所表达的IL-1 β mRNA是否翻译成蛋白质以及IL-1在脑缺血后期是否还起作用尚不明确。本研究采用永久性脑缺血模型，运用免疫组化法探讨脑缺血IL-1 β在脑内的表达情况。
1 材料与方法
1.1 动物分组 选用成年、雄性SD大鼠，体重250～300 g，由本院实验动物中心提供；按缺血时间分为脑缺血1、2、3、6、12、24、48、72 h,1、2、3、4、5、6、7 W，2个月及正常对照各1组，缺血组各配1假手术组，每组大鼠3～5只。
1.2 脑缺血动物模型的建立 采用Longa等［3］建立的方法并有所改良。步骤为用10%水合氯醛麻醉动物(370 mg/kg体重)后，取颈部正中切口，暴露右颈总及颈内、外动脉，在近心端结扎颈总动脉，在颈动脉分叉处结扎颈外动脉；距颈动脉分叉0.5 cm处将颈总动脉剪一小口，插入直径为0.165 mm的单尼龙丝，经颈内动脉达大脑中动脉起始部，堵塞其开口，进线长度为17～20 mm，再次结扎颈总动脉，缝合切口。假手术者除不插线外其余相同。正常对照组无任何处理。
1.3 脑组织准备 在各时间点给动物以过量水合氯醛腹腔麻醉，拔出栓塞线；经升主动脉灌注固定，先快速灌注100 mL生理盐水，再持续灌注4 ℃预冷、0.1 M PB配制的4%多聚甲醛1?000 mL，灌注完毕后取脑于4℃后固定24小时；在0.1 M PB配制的20%蔗糖中浸泡24小时。于-15℃条件下在冷冻切片机上冠状连续切片，片厚50 μm，脑片入0.01 M PBS中充分漂洗。
1.4 免疫组织化学 切片依次入：含3%过氧化氢的0.01 M PBS，室温，5 min；0.2% Triton X-100 PBS，室温，20 min;10%正常山羊血清，室温，10 min；小鼠抗人IL-1 β抗体(1∶200，购于北京邦定生物医学公司)中，4℃湿盒内48 h；生物素标记的鼠抗IgG(1∶200)，湿盒内室温4 h；HRP标记的链霉卵白素(1∶200），湿盒内室温4 h。以上各步骤间均先用0.01 M PBS(pH 7.5)漂洗标本，室温，10 min×3。然后DAB(0.04%)、硫酸镍铵(3%)、葡萄糖(0.2%)、氯化胺(0.04%)及葡萄糖氧化酶(0.000?8)呈色，0.1 M AB液终止染色。1%明胶贴片，自然凉干后梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片及光镜下观察。
2 结果
正常和假手术大鼠脑内以及脑缺血后的非缺血半球均未发现IL-1 β免疫反应阳性细胞。脑缺血3小时后的各时点，在缺血半球都有IL-1 β免疫反应阳性细胞，均呈星形胶质细胞的形态，随缺血时间的延长，IL-1 β阳性细胞数逐渐增多，活化程度逐渐增高。脑缺血3小时后，缺血区有散在的IL-1 β阳性细胞，呈未活化的星形胶质细胞形态(图1)；脑缺血24小时后，阳性细胞呈轻度活化的星形胶质细胞形态(图2)；脑缺血2周后，IL-1 β阳性细胞数明显增多，主要位于梗死灶周围，呈明显活化的星形胶质细胞形态(图3)；脑缺血4周后，坏死灶周围有大量IL-1 β阳性、明显活化的星形胶质细胞，呈胶质疤痕状(图4)；直到脑缺血后2个月，坏死灶周围仍有大量明显活化的IL-1 β阳性星形胶质细胞。
3 讨论
就目前研究所知，IL-1参与了脑缺血后脑水肿的形成、白细胞向缺血区的浸润及神经元坏死［2，4，5］；脑缺血后，缺血侧有IL-1 β mRNA的表达［1］；但是，起上述作用的IL-1是中枢神经系统内源性还是外源性、缺血侧所表达的IL-1 β mRNA是否翻译成蛋白质、以及在脑缺血的后期IL-1是否还起作用，目前尚不明确。为此，本实验运用免疫组化方法对大鼠永久性局灶脑缺血后IL-1 β在脑内的表达情况进行系统研究。
本实验在正常及假手术大鼠脑内均未发现有IL-1 β样免疫反应阳性细胞，与文献报道一致［1，6，7］。Sairanen等［1］报道大鼠全脑缺血20分钟，再灌注2、8、24小时后，脑内IL-1 β mRNA表达明显增加，且主要为神经元表达，但神经元所表达的mRNA并没有翻译成蛋白质，而此时脑内主要由星形胶质细胞表达IL-1 β蛋白质，同时少突胶质细胞、小胶质细胞和血管周围的单核巨噬细胞亦有少量表达。目前仅该作者证实大鼠脑缺血后脑内有IL-1 β蛋白水平的表达。本研究证实在SD大鼠局灶脑缺血后3小时，缺血区即有IL-1 β样免疫反应阳性细胞出现，呈未活化的星形胶质细胞形态，直到缺血后2月，在缺血半球可持续检测到呈星形胶质细胞形态的IL-1 β样免疫反应阳性细胞，尤以坏死灶周围明显，且活化程度愈高。文献报道大鼠脑缺血1小时再灌注12小时后脑组织内方有中性粒细胞浸润［8］，并且，我们用H-E染色证实大鼠局灶脑缺血后3小时，缺血半球无白细胞浸润，因而排除了此时脑内所表达的IL-1 β来源于血源性细胞的可能性。故此，我们的结果提示脑缺血后，脑内有内源性的、蛋白水平的以及呈持续性的IL-1 β表达。
本实验发现，大鼠脑缺血3小时到2月，仅在缺血半球有呈星形胶质细胞形态的IL-1 β免疫反应阳性细胞，除此外，没有发现任何其它形态的阳性细胞，故此，我们认为脑缺血后脑内IL-1 β抗体，又没有用其它特异性的细胞标记物做复染，因此亦不能除外在局灶脑缺血时，其它细胞产生IL-1 β蛋白的可能。
有实验证实脑损伤后受损脑区脑组织内有IL-1存在，这种IL-1可以刺激星形胶质细胞增生及促进胶质疤痕的形成，IL-1的这种作用有可能是通过直接作用于星形胶质细胞或是在局部刺激其它生长因子产生而实现的［9］。本实验从形态学角度证实缺血性脑损伤后3小时到2个月，脑内始终只有星形胶质细胞表达IL-1 β，因此推测脑缺血损伤后，IL-1具有促进星形胶质细胞增生及胶质疤痕形成的作用，并且很可能是直接作用。
Fig 1Scattering distributed IL-1β Positive immunoreactive astrocytes were found in ischemic region 3hours after ischemia (×300)
1 脑缺血3h后，缺血区有散在的星形胶质细胞表达IL-1β。×300
Fig.2 There wer some sligtly activated IL-1βpositive immunoreactive astrocytes in ischemic area 24hours after ischemia(×300)
2 脑缺血24h后缺血侧有轻度活化的星形胶质细胞表达IL-1β，表现为胞体稍肥大、突起稍增粗×300
Fig.3 Many prominently activated IL-1βpositive immunoreactive astrocytes were found in regions around the infarct two weks agter ischemia(×300)
3 脑缺血2周后梗塞灶周围IL-1β阳性星形胶质细胞明显活化，胞体肥大、突起增粗×300
Fig.4 There were abundant highly activated IL-1βpositive immunoreactive astrocytes around the necrotic region and in the form of astroglial formation four weeks after ischemia(×300)
4 脑缺血4周后，坏死灶周围有大量IL-1β阳性、明显活化的星形胶质细胞×300
参考文献
1，Sairanen TR, Lindsbery PJ, Brenner M, et al. Global forebrain ischemia results in differential cellular expression of interleukin-1 β(IL-1 β) and its receptor at mRNA and protein level. J Cereb Blood Flow Metab, 1997,17(10):1107
2，Schielke GP, Yang GY. Shivers BD, et al. Reduced ischemic brain injury in interleukin-1 β converting enzyme-deficient mice. J Cereb Blood Flow Metab, 1998,18(2):180
3，Longa EZ, Weinstein PR, Carlson s, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat. Stroke, 1989,20(1):84
4，Yamasaki Y, Matsuura N, Shozuhara H, et al. Interleukin-1 as a pathogenetic mediator of ischemic brain damage in rats. Stroke,1995,26(4):676
5，Stroemer RP and Rothwell NJ. Corticol protection by localized striatal injection of IL-1 ra following cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab,1997,17(6):597
6，Szaflarski J, Burtrum and Silverstein FS. Cerebral hypoxia-ischemia stimulates cytokine gene expression in perinatal rats. Stroke,1995,26(6):1093
7，Minami M, Kuraishi Y, Yabuuchi K, et al. Induction of interleukin-1 β mRNA in rat brain after transient forebrain ischemia. J Neurochem,1992,58(1):390
8，Takao T, Tracey DE, Mitchell WM, et al. Interleukin-1 receptors in mouse brain: characterization and neuronal localization. Endocrinology, 1990,127(6):3070
9，Giulian D and Lachman L. Interleukin-1 stimulation of astroglial proliferation after brain injury. Science,1985,228()4698:497
(收稿)